师：同学们，大家好，今天我们要复习的内容是基因工程。首先，一起回顾本专题的内容体系。基因工程这一章主要涉及一项技术、两个工程、三种工具、四个基本步骤，以及基因工程在多方面的应用。

　　一项技术指的是PCR技术，它能在体外快速扩增DNA片段，在现代分子生物学和基因工程中应用广泛。基因工程可实现体外DNA重组，需借助三种工具：限制酶、DNA连接酶、运载体。基因工程的四个步骤为：第一步目的基因的获取；第二步基因表达载体的构建，这也是基因工程的核心步骤；第三步将目的基因导入受体细胞；第四步目的基因的检测与鉴定。

　　随着基因工程的快速发展，它在农牧业、环保、医药、食品等各个领域广泛应用，成果丰硕。但基因工程有局限性，只能生产自然界已有的蛋白质，于是第二代基因工程——蛋白质工程应运而生。蛋白质工程能通过改造基因，生产出自然界不存在的蛋白质，更好满足人类生产生活需求。

　　下面以转基因抗虫棉的培育为例，复习基因工程的有关知识。培育转基因抗虫棉时，我们要考虑哪些问题呢？苏云金芽胞杆菌可产生BT抗虫蛋白，破坏鳞翅目昆虫消化系统，杀死棉铃虫。这个杀虫基因就是培育转基因抗虫棉所用的目的基因，简称BT基因。那我们如何获得BT基因？获得的BT基因能否直接导入棉花细胞？又该如何将BT基因导入棉花细胞？在棉花细胞中，目的基因是否导入成功？能否稳定维持并表达出BT蛋白？表达出的BT蛋白是否具有杀虫功效？又该如何检测？思考这些问题后，我们就能理清培育转基因抗虫棉的主要思路，明白基因工程四步操作程序的顺序及原因。

　　首先看第一个问题，如何获得BT基因。目的基因的获取有多种方法，早期培育转基因抗虫棉时，科学家利用人工合成的方法获得BT基因，但这种方法只适用于基因较小且核苷酸序列已知的情况。我们还可以从生物材料中提取DNA，将该生物的所有基因借助运载体导入受体菌群保存，创建该生物的基因组文库。也可以从生物材料中提取某一发育时期的mRNA，以RNA为模板，通过反转录得到cDNA，再将得到的cDNA借助运载体导入受体菌群保存，创建cDNA文库。然后根据目的基因的相关信息，从这两类文库中获取目的基因。

　　随着PCR技术的发展，还能借助PCR技术选择性扩增目的基因。目前新冠病毒的检测就利用了这项技术。下面回顾一下PCR技术，它的原理是体外DNA复制。因此，我们可以结合体内DNA复制的相关知识，分析进行PCR操作时，科研人员需向PCR反应体系中加入哪些成分，这些成分分别有什么作用，并比较PCR技术和体内DNA复制的异同，可结合模式图分析。

　　PCR技术和体内DNA复制相同之处在于，都需要DNA母链作为模板，需要4种脱氧核苷酸作为原料，还需要引物。有了引物，单个脱氧核苷酸就能连接在引物的3'羟基端进行子链延伸，这个过程需DNA聚合酶催化。但与体内DNA复制不同的是，PCR体系中用到的DNA聚合酶需具有耐高温特性。此外，还要在PCR体系中加入缓冲液维持环境的pH。

　　下面看一道例题。关于PCR技术的叙述，正确的是：A选项，PCR的反应体系中有解旋过程，与体内DNA复制需解旋酶不同，在PCR反应过程中，通过控制温度在90 - 95摄氏度来使DNA解旋；B选项，PCR过程中需要用到DNA聚合酶，但从受体细胞中提取的DNA聚合酶不具备耐高温特性；C选项，用PCR方法进行目的基因扩增时，需知道已知基因的部分序列，即目的基因两端的核苷酸序列，以便据此合成相应引物，无需知道已知基因的全部序列；D选项，PCR反应的一个循环包括变性、复性、延伸这三个过程，且这三个过程的温度变化均不相同。因此，正确的选项是D。

　　下面回顾一下PCR过程中的温度变化及目的。结合PCR过程的模式图，图中编号1对应的是PCR过程的第一步，称为变性，需将温度加热至90 - 95摄氏度，目的是让DNA双链断裂解旋为单链。图中编号2对应的是第二步，称为退火，需将温度冷却至55 - 60摄氏度，目的是让引物结合到互补DNA链上。编号3对应的是第三步延伸，需将温度加热至70 - 75摄氏度，在这一温度下，热稳定的DNA聚合酶可从引物的3'羟基端起始合成子链。完成这三步，意味着完成PCR技术的一轮循环。如此循环，DNA数量会在短时间内呈指数增加。

　　请同学们思考，第四轮循环的产物中同时含有引物a和引物b的DNA片段所占比例是多少？借助模式图分析，这是一个DNA片段，只有中间部分是目的基因，根据目的基因两端核苷酸序列合成相应引物，引物a用绿色表示，引物b用紫色表示。在引物引导下，子链朝着5'到3'端方向延伸。经过一轮复制，一个DNA扩增得到两个DNA，这两个DNA只含引物a或只含引物b。继续看第二轮复制，以四条母链为模板，得到4个DNA，其中有两个DNA既含引物a又含引物b。扩增三次会得到8个DNA，其中有6个DNA同时含有引物a和引物b。那么扩增n次的情况，不管扩增多少次，只有两个DNA只含引物a或只含引物b，其他都同时含有引物a和b。因此，第四轮循环的产物中同时含有引物a和引物b的DNA占的比例是14/16。

　　同学们发现是在第几次扩增时出现了我们要的目的基因吗？在第三轮复制时出现了所需目的基因，且8个DNA中只有两个是目的基因。在PCR过程中，引物的设计有什么原则呢？需注意引物的数量和结合位置。扩增一段DNA需要两种引物，两条子链分别从相应引物的3'端开始延伸，设计引物的原则是根据已知目的基因两端的核苷酸序列合成。但如果出现图示现象，比如第一组引物，若引物内部可通过碱基互补，引物就无法与模板链结合而失效。再如第二组引物中的引物1'，若能通过自身折叠实现内部碱基互补结合，这样的引物也是无效的。这是设计引物时需注意的。